ABSTRACT
The aim of this study was to establish the protocol of conventional and real time PCR for amplificationof Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) genome from bovine fecal samples, as a wayto define strategies for establishing a prevention and control program in a dairy herd at the Universidadde Antioquia (Medellín, Colombia). Fecal samples were individually taken of clinical healthy cows orcows with diarrhea bred in a herd enzootic for Johnes disease, were processed them for culture in liquidMiddlebrook 7H9 media supplemented with mycobactin under two different protocols: with or withoutinhibitors. Fecal samples from clinically healthy cows were used as negative control. Conventional andreal time PCR were performed with MAP DNA obtained of fecal or cultured samples. The MAP- specificIS900 segment was amplified by using the respective forward and reverse primers. DNA isolated from areference MAP strain was used as positive control of PCR. Data were analyzed by descriptive statisticsand simple regression analysis between PCR and culture results were performed. All samples culturedin media with or without mycobactin gave a positive result compatible with MAP growth. However, only13,3% of samples were positive by real time PCR. There was no relationship neither between PCR and culture results, nor between clinical condition of the cow and MAP positivity. These results support theneed combine culture of feces with PCR diagnosis for identification of MAP-excreting cows in a dairyherd. Finally, a strategy of prevention and control of bovine paratuberculosis is proposed for this enzooticherd and for dairy herds in Colombia.
El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de detección y amplificación del Mycobacteriumavium paratuberculosis (MAP) a partir de muestras de materia fecal bovina, mediante el uso de la técnicade PCR en tiempo real, como estrategia de apoyo para el establecimiento de un programa de prevencióndetección y control de la paratuberculosis bovina en el hato lechero de la Universidad de Antioquia. Muestrasde materia fecal fueron tomadas de bovinos provenientes de un hato enzoótico para la enfermedad de Johne,fueron cultivadas en medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 suplementado con micobactina, bajo dosprotocolos de aislamiento: con o sin inhibidores. Como control negativo fue utilizada muestras de materiafecal de bovinos clínicamente sanos. Adicionalmente, con el DNA de las muestras aisladas en cultivo yde las muestras de materia fecal, fueron hechas pruebas de PCR convencional y en tiempo real, para laamplificación del elemento de inserción IS900 del MAP, mediante el uso de cebadores específicos para esteelemento. Como control positivo se utilizó DNA de MAP de una cepa de referencia. Los resultados fueronevaluados mediante estadística descriptiva y la comparación entre el resultado del cultivo y de la pruebade PCR fue evaluado mediante regresión simple. Los resultados del cultivo bacteriológico, mostraron untotal de 15 muestras con crecimiento compatible con MAP, el cual fue verificado por prueba de PCR enel 13.3% de los casos. No hubo correlación entre el resultado de cultivo y la prueba de PCR ni entre elestado clínico y la positividad al MAP. Los resultados confirman la necesidad de combinar el diagnósticomolecular con el cultivo bacteriológico para identificar las vacas positivas en un hato. Finalmente, unaestrategia de prevención y control de la enfermedad aplicable a este hato enzoótico y a los hatos lecherosen Colombia es discutida.
O objetivo deste estudo foi estabelecer um sistema de detecção e amplificação do Mycobacterium aviumparatuberculosis (MAP) a partir de amostras fecais bovinas, utilizando a técnica de PCR em tempo real,como uma estratégia para apoiar o estabelecimento de um programa rastreio para a prevenção e controlede la paratuberculosis bovina no rebanho leiteiro da Universidade de Antioquia. Foram colhidas amostrasde fezes de gado bovino a partir de uma fazenda enzoótica para a doença de Johne, e foram cultivadasem meio de cultura líquida Middlebrook 7H9 suplementado com micobactina, sob dois protocolos deisolamento: com ou sem inibidores. Foram utilizadas como controle negativo amostras fecais de bovinossaudáveis. Além disso, as amostras de DNA isoladas e cultivadas a partir de amostras fecais foramrealizadas testes de PCR convencional e em tempo real, para amplificação elemento de inserção IS900 noMAP. Foi utilizado como controle positivo do teste DNA de uma estirpe de referencia. Os resultados foramavaliados por estatística descritiva e as comparações entre os resultados de cultura e teste PCR foramavaliadas por regressão simple. Os resultados de cultura bacteriológica mostraram 100% de crescimentoem amostras com MAP, que foi verificada por PCR em 13,3% dos casos. Não houve correlação entre oresultado do cultivo e teste PCR ou entre a clínica e a positividade para MAP. Os resultados confirmam anecessidade de combinar o diagnóstico molecular com cultura bacteriológica para identificação positivade vacas em um rebanho. Finalmente, uma estratégia de prevenção e controle da doença aplicável nesterebanho enzoótico e os rebanhos leiteiros e na Colômbia é discutida.